Artykuł: Bakterie w Cyklu Azotowym

Opublikowano: 6 stycznia 2018 r.

Cykl Azotowy – podstawy

Znajomość cyklu azotowego jest nierozerwalnie związana z naszym domowym akwarium, które jest małym, ale w pełni działającym ekosystemem. Każdy, kto pragnie, aby jego prywatny wodny świat był ozdobą, musi znać przynajmniej podstawowe informacje na temat zachodzących w nim procesów. Cykl azotowy ma duży związek z jakością wody, a jego nieznajomość prowadzi do wahań jej parametrów, co często kończy się plagą glonów lub chorobami.
Problemem jest fakt, iż im mniejszy ekosystem próbujemy stworzyć, tym łatwiej na niego wpłynąć, a więc i zaburzyć. Z tego względu początkującym nigdy nie należy polecać zbyt małego zbiornika.
Jaką rolę odgrywają w nim bakterie? Czy proces ten można przyspieszyć lub zwiększyć jego wydajność? Na te i inne pytania postaram się odpowiedzieć w poniższym artykule.

Na początek wyjaśnijmy, czym jest azot oraz jaka jest jego rola w zbiorniku. Azot jest jednym z głównych pierwiastków występujących we wszystkich organizmach żywych. Dotyczy to roślin, zwierząt oraz nas – ludzi. Nic w tym dziwnego: zawartość procentowa azotu w otaczającym nas powietrzu to aż 78%, więc natura miała praktycznie nieograniczone jego źródło. Właściwości chemiczne tego pierwiastka, duża ilość możliwych do wytworzenia wiązań i specyfika jego zachowania w różnych warunkach fizycznych może wielu zadziwić.

Pomiar poziomu amoniaku [źródło: fishlore.com]

Pomimo tak wielkiej dostępności azotu w powietrzu, w postaci cząsteczkowej (N2) dla organizmów wodnych jest on praktycznie nieprzyswajalny, a jego rozpuszczalność w wodzie jest bardzo niewielka.
Jak w takim razie przedostaje się do wody?
Źródeł związków amonowych (czyli zawierających azot) w wodzie jest naprawdę wiele: od efektu rozkładu związków organicznych (obumarłych części roślin, martwych zwierząt, produktów przemiany materii) przez opady deszczu (kwaśny deszcz, którego jednym ze składników są tlenki azotu) do efektów działalności człowieka (ścieki komunalne i przemysłowe).

Azot w wodzie występuje w kilku postaciach, m.in. NH3 (amoniak), NH4+ (jon amonowy, jako wynik rozpadu soli amonowych, np. w nawozach), NO2 (jon azotanowy (III) dawniej nazywany „azotynami”) oraz NO3 (jon azotanowy (V) dawniej zwany „azotanami”).

Jon amonowy jest stosunkowo niegroźny w środowisku wodnym. Jak już wspomniano, stosuje się go w nawozach. Na potrzeby tego artykułu skupimy się w takim razie na trzech związkach azotu uszeregowanych od najbardziej do najmniej toksycznego: NH3, NO2, NO3.

Amoniak (NH3) jest najniebezpieczniejszym z wymienionych związków. Bez wydajnego, biologicznego systemu filtracji jesteśmy skazani na jego obecność w akwarium, ponieważ jest głównym metabolitem wydalanym przez ryby. Dlaczego? Ryby to zwierzęta amonioteliczne, a więc takie, które jako produkt przemiany materii wydalają amoniak. Sytuacja taka nie zdarza się np. u zwierząt lądowych, ponieważ amoniak ze względu na swoją wysoką toksyczność wymaga dużego rozcieńczenia w organizmie przed wydaleniem – stąd amonioteliczność jest charakterystyczna wyłącznie dla zwierząt żyjących w środowisku wodnym, gdzie rozcieńczanie jest praktycznie nieograniczone.
Amoniak uszkadza narządy oddechowe (u ryb skrzela), niszczy ochronną warstwę śluzu na ciele ryby. W przypadku braku reakcji z naszej strony na wzrost stężenia NH3 w wodzie (dawka śmiertelna w zależności od wieku ryby to 0,2- 2,0mg/dm3) powoduje śnięcie ryb w zbiorniku.
Bardzo ważną informacją jest fakt, iż rozpuszczalność amoniaku w wodzie wzrasta wraz z temperaturą oraz zasadowością (pH) wody w zbiorniku. Szczególną uwagę zatem powinni na niego zwracać właściciele akwariów z biotopem jezior Malawi i Tanganika i wyposażać swoje filtry w wysokiej jakości wkłady biologiczne.

Azotany (III), zwane według dawnej nomenklatury „azotynami” (NO2) są drugim (a właściwie trzecim) związkiem w łańcuchu reakcji unieszkodliwiania azotowych produktów przemiany materii przez bakterie nitryfikacyjne, na których wkrótce mocniej skupimy naszą uwagę. Tolerancja jego obecności w wodzie jest wyższa niż w przypadku amoniaku (dawka śmiertelna 5mg/dm3). Jego obecność często stwierdza się w świeżo założonych zbiornikach, do których szybko wpuszczane są ryby, a do którego dodajemy bakterie nitryfikacyjne. Amoniak (i jon amonowy) są szybko przez nie przetwarzanie w pierwszym stopniu nitryfikacji, ale do dalszego ich przetworzenia w mniej toksyczną formę potrzeba czasu i stabilizacji biologicznej. W ich usunięciu, a raczej neutralizacji, pomagają na szczęście preparaty dostępne w handlu.

Azotany (V), zwane w związku z dawną nomenklaturą po prostu „azotanami” są najmniej szkodliwym związkiem azotu występującym w akwarium i efektem działania w pełni „sprawnego” biologicznego systemu oczyszczania wody. Jako jedyne stale kumulują się w stabilnych zbiornikach, ponieważ do ich usunięcia potrzeba bakterii denitryfikacyjnych (przekształcających NO3 w wolny azot cząsteczkowy N2, który wydostaje się ze zbiornika do atmosfery) lub specjalnych roślin. Oczywiście pozbywamy się ich często nieświadomie poprzez regularne podmiany wody. Inną możliwością usunięcia (a raczej wspomagania ich usunięcia, ponieważ podmiany wody są niezbędne) jest umieszczenie w filtrze wkładu biologicznego przeznaczonego do namnażania się na powierzchni porów bakterii beztlenowych. Wymagania takiego procesu są dosyć złożone, o czym przekonamy się później.
Za granicę niebezpieczną dla ryb uważa się stężenie NO3 na poziomie 50mg/dm3, natomiast stężenia powyżej 100mg/dm3 mogą spowodować straty w zbiorniku.

Bakterie nitryfikacyjne – ogólna charakterystyka

Bakterie najogólniej podzielić można na tlenowce i beztlenowce.
Charakterystyka ta świetnie obrazuje nam ich podstawowe wymagania. Bakterie nitryfikacyjne należą do tlenowców, tzn. do życia i przeprowadzania reakcji niezbędnych dla ich funkcjonowania potrzebny jest tlen w formie cząsteczkowej.
Przy okazji omawiania biologicznych zasobów gleb na biologii, każdy z nas zapewne spotkał się z określeniem, iż bakterie te należą do chemolitoautotrofów. Pozwolę sobie przypomnieć trzy charakterystyczne dla tej grupy cechy:
1. Źródłem energii niezbędnej do życia jest energia chemiczna
2. Donorem (źródłem niezbędnych do reakcji) elektronów jest związek nieorganiczny
3. Źródłem węgla jest CO2 (dwutlenek węgla).
Występują one oczywiście w każdym środowisku: wodzie, glebie, a nawet w powietrzu.

Nitrobacter sp. [źródło: blog.coralwonders.com]

Bakterie nitryfikacyjne czerpią energię z utleniania amoniaku i jonu amonowego do jonów azotanowych. Reakcję taką można również przeprowadzić w warunkach laboratoryjnych. Problem w tym, iż wynikiem takiego doświadczenia jest uzyskanie stosunkowo niewielkiej ilości energii, która w praktyce nie wystarczy do podtrzymania funkcji życiowych bakterii. Jak w takim razie zapewnić sobie energię, skoro tak mało można jej pozyskać w jednostce czasu? Tutaj z pomocą przychodzi natura, która niebywale nas zaskakuje – bakterie nitryfikacyjne na drodze ewolucji wykształciły bowiem niezwykle wydajne działanie tego procesu. Pozwala to na jego przyspieszenie (uzyskanie dużej efektywności), a co za tym idzie, wytworzenie odpowiednio dużej ilości energii niezbędnej do przeżycia i namnażania.
Co ciekawe, przy zachowaniu odpowiedniego stosunku azotu do fosforu w wyniku działania bakterii nitryfikacyjnych obserwuje się spadek stężenia obu tych związków jednocześnie. Jest to jednak temat na osobny artykuł.

Nitryfikacja jest procesem bardzo złożonym. Postaram się wytłumaczyć wszystkie reakcje i objaśnić zachodzące zjawiska. Nie będziemy pomijać żadnego z etapów, co ma często miejsce w innych tego typu artykułach.

W pierwszym etapie nitryfikacji utleniamy amoniak do hydroksyloaminy. Jak już wyżej wspomniałem, najwyższe stężenia amoniaku w wodzie obserwujemy w akwariach, w których utrzymuje się wysoką temperaturę oraz zasadową wartość pH (powyżej 7,0). Łatwo z tego faktu wywnioskować, iż do reakcji, w której ze środowiska ubywa NH3 potrzebne jest środowisko lekko kwaśne. Oczywiście zakres pH dla tej reakcji jest zmienny, a podyktowane jest to łatwością przekształcenia NH3 w jon amonowy NH4+, który w wodzie jest sprzężony z jej cząsteczką pod postacią NH3•H2O i wykazuje właściwości zasadowe. Z tego względu reakcja nitryfikacji zachodzi w sposób niezaburzony nawet przy wartościach pH równych 8,0.

Przypomnijmy szybko zasadę dotyczącą obecności jonów w zależności od pH wody.
W przypadku pH wody poniżej 7,0 obserwujemy większe stężenie jonów H+ (kationu wodorowego, protonu) niż OH (anionu hydroksylowego)
W przypadku pH wody powyżej 7,0 obserwujemy większe stężenie jonów OH niż H+
W przypadku pH wody równego 7,0 jony H+ i OH neutralizują się wzajemnie w myśl reakcji H+ + OH → H2O

W wodzie zatem znajdują się jony H+ (im niższe pH tym więcej), które są niezbędne, obok tlenu atmosferycznego i źródła elektronów, do przeprowadzenia amoniaku w hydroksyloaminę. W reakcjach tlenowych elektrony pozyskiwane są ze związków nieorganicznych.
NH3 + O2 + 2H+ + 2ē → NH2OH + H2O
Widzimy, jak amoniak przy udziale tlenu, dwóch protonów (H+) i dwóch elektronów przekształcany jest w hydroksyloaminę i wodę. Hydroksyloamina jest substancją trującą i wykazuje silne działanie mutagenne. Nie chcemy jej w wodzie, więc czym prędzej przejdźmy do kolejnego etapu reakcji nitryfikacji, w którym to hydroksyloamina pod wpływem wody hydrolizuje na jon azotanowy (III), pięć protonów i 4 elektrony.
NH2OH + H2O → NO2 + 5H+ + 4ē
W ten sposób uzyskaliśmy z amoniaku około 100-krotnie mniej toksyczny jon azotanowy (III). Oczywiście „mniej toksyczny” nie oznacza „nieszkodliwy”.
Powyższe dwie reakcje możemy zapisać sumarycznie, z pominięciem hydrolizy hydroksyloaminy, w następujący sposób:
2NH3 + 3O2 → 2NO2 + 2H+ + 2H2O
Pierwszy etap reakcji pokazany powyżej zachodzi przy udziale bakterii z rodzajów Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosolbus.

Kolejnym etapem jest dalsze zwiększenie stopnia utlenienia azotu w myśl zasady „im wyższy stopień, tym mniejsza szkodliwość”. Oczywiście zasada ta nie dotyczy azotu cząsteczkowego (na zerowym stopniu utlenienia).
NO2 + H2O → NO3 + 2H+ + 2ē
Z anionu azotanowego (III) pod wpływem wody, z kolejnym udziałem bakterii uzyskujemy anion azotanowy (V), dwa protony oraz dwa elektrony. Przebieg tej reakcji wspomagają bakterie z rodzajów Nitrospira, Nitrobacter oraz Nitrococcus.

Zgodnie z powyższymi reakcjami, proces nitryfikacji możemy zapisać za pomocą jednego, następującego schematu:
NH3 + 2O2 → NO3 + H+ + H2O

Rogatek sztywny [źródło: amazon.com]

Bardzo często spotykam się ze stwierdzeniem, iż ktoś nie musi podmieniać wody w akwarium, ponieważ ma dużo roślin, a one do wzrostu potrzebują azotanów. Jest to niestety założenie błędne. Na drodze ewolucji rośliny nauczyły się wykorzystywać związki azotu na niskim stopniu utlenienia, czyli jon amonowy (NH4+) oraz, w mniejszym stopniu, NO2. Otóż NO3 nie bez powodu kumuluje się w zbiorniku. Ma to związek z dużą stabilnością tego anionu. Skoro jest bardzo trwałym anionem, to ciężko pozyskać z niego azot (N) niezbędny do wzrostu roślin. Jeżeli są w wodzie związki mniej stabilne, a więc łatwiejsze do rozkładu, to po co roślinie męczyć się z NO3?
Oczywiście natura jest przygotowana również na sytuacje, w których w wodzie prawie wyłącznie występują jony azotanowe (V). Przykładem rośliny ewolucyjnie przystosowanej do ich pochłaniania jest Rogatek sztywny (Ceratophyllum demersum). Między innymi z tego względu warto go mieć w swoim zbiorniku.

Bakterie nitryfikacyjne niestety nie są nieśmiertelne. Wręcz przeciwnie – wykazują dużą wrażliwość na nagłe zmiany parametrów wody (m.in. temperatury) oraz metale ciężkie, chlor, składniki leków stosowanych w akwarystyce. Co ważne, nie produkują, w przeciwieństwie do wielu innych bakterii, przetrwalników. Z tego względu w niesprzyjających warunkach zużywają jedynie zgromadzone zapasy energii i bezpowrotnie giną.
Sytuacja taka pojawia się np. przy przerwie w dostawie prądu, gdy tlen zawarty w wodzie otaczającej wkład filtracyjny zostaje bardzo szybko zużyty w drodze wciąż postępującej reakcji lub wypłuczemy wkłady filtracyjne w wodzie kranowej.

Proces denitryfikacji

Denitryfikacja polega, w dużym uproszczeniu, na wykorzystaniu tlenu zawartego w związkach obecnych w środowisku do produkcji energii. Najbardziej charakterystyczną cechą środowiska, w którym bytują bakterie odpowiedzialne za ten proces, jest brak lub niebywale niska wartość tlenu cząsteczkowego (O2). Tylko takie warunki na drodze ewolucji mogły zmusić bakterie z rodzaju Pseudomonas, Bacillus, Thiobacillus czy Escherichia do korzystania z tlenu związanego w anionach. Zatem, aby wyprodukować energię, bakterie beztlenowe musiały znaleźć sposób na oderwanie cząsteczki tlenu od jonu NO3.
Jak już wspomniałem, proces ten jest ściśle zależny od braku O2 w układzie. W innym wypadku bakterie beztlenowe zostałyby wyparte przez bakterie tlenowe, ponieważ to właśnie tym drugim środowisko by bardziej sprzyjało.
Należy także zwrócić uwagę na pewną anomalię związaną z bakterią Paracoccus denitrificans, która występuje w cyklicznie natlenianych osadach morskich. Za pomocą enzymu (jednej z reduktaz) potrafi ona przeprowadzić proces denitryfikacji nawet w okresowo natlenionym środowisku.

Paracoccus denitrificans [źródło: blog.coralwonders.com]

Warto w tym miejscu także objaśnić najprostszy sposób sprawdzenia, z jakimi warunkami mamy do czynienia. Wykorzystuje się tutaj pomiar przewodności wody. Do pomiaru służy odpowiedni elektroniczny miernik. W warunkach tlenowych przewodność wody jest dodatnia (np. +100mV), natomiast w warunkach beztlenowych – ujemna (np. -100mV).

Aby w akwarium wytworzyć w bezpieczny sposób warunki beztlenowe mamy tak naprawdę dwie możliwości. Najbardziej zaawansowanym sposobem usuwania azotanów ze zbiornika jest zastosowanie reduktora azotanów. Jest to urządzenie w kształcie filtra kubełkowego (kanistrowego), najczęściej spięte z miernikiem przewodności elektrycznej. Woda przez reduktor przepływa bardzo wolno (jeśli jest spięty z miernikiem, to miernik uruchamia pompę w zależności od wskazań przewodności wody). Tak niewielki przepływ pozwala na zużycie tlenu w reakcjach zachodzących w wodzie w jednostce objętości zanim trafi ona do reaktora, do którego tlen dostać się nie może.

Bakterie w tym procesie wspomagają przeprowadzanie czterech różnych reakcji.
Do każdej z nich zużywają po dwa protony (kationy wodorowe) oraz elektrony. Z każdym kolejnym etapem związek azotu jest mniej trwały, a więc łatwiej pozyskać z niego energię. Reakcje (z udziałem enzymów) wyglądają następująco:
NO3 + 2H+ + 2ē → NO2 + H2O Redukcja azotu (V) do azotu (III)
NO2 + 2H+ + ē → NO + H2O Redukcja azotu (III) do azotu (II)
2NO + 2H+ + 2ē → N2O + H2O Redukcja azotu (II) do azotu (I)
N2O + 2H+ + 2ē → N2 + H2O Redukcja azotu (I) do azotu cząsteczkowego (0)

Jak widać powyżej, w przypadku przeprowadzania procesu denitryfikacji konieczne jest dostarczenie dużej ilości protonów i elektronów. Z tego względu obsługa reduktora azotanów polega na „karmieniu” bakterii. W profesjonalnych reduktorach stosuje się do tego celu biodegradowalne polimery, ale równie dobrym źródłem protonów i elektronów jest sól kwasu octowego. Omawiana reakcja sumarycznie wygląda następująco:
5CH3COO + 8NO3 + 3H+ → 10HCO3 + 4N2 + 4H2O

Z powyższego schematu każdy, kto interesuje się akwarystyką morską, już wie, że stanowi to podstawy metody VM oraz VSVM. Ten temat rozwinę jednak w przyszłości.

Wkład biologiczny [źródło: Seachem]

Inną metodą wytworzenia w filtrze warunków beztlenowych, choć mniej wydajną, jest zakup biologicznych wkładów filtracyjnych o odpowiednio małej porowatości pozwalającej na maksymalne ograniczenie przepływu wody. Takie środowisko pozwala na rozwój bakterii beztlenowych. Producent bardzo często określa maksymalny możliwy przepływ wody przez takie medium. Jeśli próg ten zostanie przekroczony, ilość bakterii beztlenowych na złożu ulegnie redukcji lub degradacji.

W użytkowaniu reduktora azotanów czy też wkładów filtracyjnych stosowanych do wytworzenia warunków beztlenowych jest jednak spora pułapka. Otóż spadek przewodności wody poniżej -300mV oznacza, iż w wodzie zabrakło już jonów azotanowych. Bakterie beztlenowe w tym wypadku, aby przetrwać zaczynają poszukiwać innego źródła energii. Ich kolejnym wyborem jest najczęściej jon siarczanowy. Sytuacja staje się o tyle niebezpieczna, iż w wyniku jego redukcji powstaje zabójczy dla większości istot żywych siarkowodór (H2S).
Charakterystyczną cechą tego gazu jest zapach zgniłych jaj. W przypadku jego wystąpienia, wkład (filtra czy reduktora) praktycznie nie nadaje się do reaktywacji, należy go wymienić na nowy. Dlatego tak ważne jest monitorowanie przebiegu procesu denitryfikacji.

Warto podkreślić, iż niemożliwe jest bezpieczne wytworzenie warunków beztlenowych w akwarium bez zastosowania przeznaczonego do tego wkładu filtracyjnego lub zakupu (czy też wykonania metodą DIY) reduktora azotanów. W standardowym filtrze (gąbkowym) oraz przy zastosowaniu zwykłego wkładu biologicznego bakterie beztlenowe nie mają możliwości namnażania się lub proces ten jest bardzo ograniczony przez wszechobecny, rozpuszczony tlen. Warunki beztlenowe powstają także, gdy w akwarium posiadamy grubą warstwę mułu (martwej materii organicznej), przez którą nie może przepłynąć natleniona woda. W takich miejscach najczęściej dochodzi do wytworzenia siarkowodoru H2S, który powoduje śnięcie ryb w zbiorniku. W starszych zbiornikach po poruszeniu głębszych warstw żwiru zauważyć można ulatujące bąbelki gazu o nieprzyjemnym zapachu. Jest to właśnie efekt działania bakterii beztlenowych przy braku jonów azotowych.

Cykl Azotowy – ile czekać?

Czy można zatem określić, ile trwa pełny cykl azotowy? Przed odpowiedzią na to pytanie warto jeszcze zwrócić uwagę na jeden bardzo istotny szczegół. Wszystkie bakterie obecne we wkładach biologicznych największą wydajność uzyskują tworząc kolonię. Proces taki musi trwać odpowiednio długo. Nie wystarczy zatem wlanie bakterii do wody z nadzieją, że wszystko będzie dobrze. Owszem – mamy większą pewność, że na przykład „awaryjnie” wpuszczone ryby przetrwają, a środowisko do którego trafią nie wpłynie negatywnie na ich kondycję, jednak uzyskanie pełnej wydajności układu biologicznego musi potrwać.
W naturalnie założonym zbiorniku (bez ingerencji w postaci dodawania do wody gotowej mieszaniny szczepów) bakterie odpowiedzialne za pierwszy etap oczyszczania wody pojawiają się po 7-14 dniach. Bakterie odpowiedzialne za drugi etap pojawią się w zbiorniku po 12-21 dniach. Aby ustalić równowagę w akwarium cykl musi się w pełni zamknąć przy odpowiedniej do zapotrzebowania ilości bakterii. Mówimy zatem o 40-50 dniach dojrzewania zbiornika słodkowodnego. Przy zastosowaniu dobrej jakości mieszaniny szczepów bakterii, proces dojrzewania zbiornika może przyspieszyć nawet kilkukrotnie. Nie ma na chwilę obecną jednak sposobu na sprawienie, iż w świeżo założonym zbiorniku uzyskamy równowagę biologiczną w 24-48 godzin.
Fakt stabilizacji cyklu z zbiorniku zauważymy także przy wykonywaniu testów wody. Przed wpuszczeniem do zbiornika ryb poziomy NH3 i NO2 muszą być zerowe, a stężenie NO3 powinno być stosunkowo niskie.

Bardzo ważną informacją jest to, iż ilość bakterii nitryfikacyjnych i denitryfikacyjnych jest ściśle powiązana z ilością metabolitów koniecznych do przetworzenia. Jak wyżej wspominałem, bakterie te nie produkują przetrwalników, więc ich ilość w koloniach ustala się na poziomie niezbędnym do zamknięcia cyklu. Co to dla nas oznacza?
Najlepszą opcją jest stopniowe wprowadzanie zwierząt akwariowych do zbiornika. Pozwoli to na reakcję ze strony kolonii bakterii, dla której impulsem do namnażania będzie możliwość uzyskania większej ilości energii z większej dostępnej ilości metabolitów. Wprowadzajmy zatem ryby etapami, aby środowisko, w którym żyją, mogło nadążyć za produkcją amoniaku i jego pochodnych.

Przytoczone powyżej fakty i rozwiązania mają na celu objaśnienie wszystkim niektórych procesów zachodzących w akwariach. Regularna podmiana wody, pomiary jej parametrów, a także uzupełnianie środowiska w mikro- i makroelementy niezbędne do wzrostu roślin pomagają w zachowaniu niskich stężeń substancji zagrażających ekosystemowi.

Autor: Michał Wyskiel

Bibliografia:
Qu; et al. (2016). „Transcriptional and metabolic regulation of denitrification in Paracoccus denitrificans allows low but significant activity of nitrous oxide reductase under oxic conditions”. PubMed – via US National Library of Medicine National Institutes of Health.
http://www.nitrification.org
http://www.fishdoc.co.uk/filtration/nitrification.htm
Burrell P.C. & Co (2001) – Identification of Bacteria Responsible for Ammonia Oxidation in Freshwater AquariaApplied and Environmental Microbilogy

Menu główne
Sklep internetowy w budowie. Darmowa wysyłka od 199zł Sprawdź teraz!
Hello. Add your message here.